Karakterisasi Produk PCR dengan Elektroforesis

     Karakterisasi Produk PCR dengan Elektroforesis

Produk PCR adalah fragmen DNA yang diinginkan dengan panjang tertentu. Penentuan dan pengamatan produk PCR berupa besarnya basa yang diperoleh dapat dilakukan dengan elektroforesis. Elektroforesis DNA merupakan teknik pemisahan fragmen DNA berdasarkan ukuran, bentuk, dan muatan listrik. Proses pemisahan fragmen DNA dengan elektroforesis dapat dilakukan pada gel agarosa atau gel poliakrilamid. Gel agarosa biasa digunakan untuk memisahkan fragmen DNA berukuran ³ 500bp, sedangkan gel poliakrilamid digunakan untuk memisahkan fragmen DNA berukuran <500bp. Gel agarosa maupun gel poliakrilamid digunakan dengan berbagai konsentrasi tergantung besarnya DNA yang dianalisis. DNA merupakan molekul bermuatan negatif. Apabila sampel DNA dimasukkan ke dalam sumur gel pada elektroda negatif atau katoda dan dialiri arus listrik dengan perendaman dalam larutan elektrolit seperti buffer TAE (Tris Asetat EDTA), maka DNA akan bermigrasi melalui gel menuju kutub positif atau anoda. Semakin rendah berat molekulnya maka semakin jauh pula DNA bergerak atau mobilitasnya tinggi. Sebaliknya, DNA dengan berat molekul lebih besar akan bergerak pada jarak  lebih pendek atau mobilitasnya rendah. Dengan demikian, molekul DNA akan terpisah menurut ukuran fragmennya (Pratiwi, 2001).

Pita-pita DNA hasil elektroforesis dapat dilihat dengan merendam gel agarosa ataupun gel poliakrilamid ke dalam larutan etidium bromida. Etidium bromida akan berinterkalasi di antara basa-basa DNA dan dapat berpendar di bawah sinar ultraviolet. Produk PCR akan terlihat sebagai pita terang dengan ukuran tertentu.

Tebal tipisnya pita DNA yang terbentuk menunjukkan banyaknya DNA yang mempunyai berat molekul yang sama yang berada pada posisi pita yang sama. Hal ini sejalan dengan prinsip pergerakan molekul bermuatan, yakni molekul bermuatan dapat bergerak bebas di bawah pengaruh medan listrik, molekul dengan muatan dan ukuran yang sama akan terakumulasi pada zona atau pita yang sama atau berdekatan. Penentuan ukuran produk PCR dilakukan dengan membandingkan ukuran produk PCR dengan penanda berat molekul.